CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated gene 9) по суті являє собою систему набутого імунітету бактерії, що виконує функцію захисту від чужинної ДНК, бактеріофагів або плазмід. Принциповий механізм дії CRISPR/Cas9 нагадує систему РНК інтерференції еукаріотів, щоправда, вона націлена не проти РНК, а проти дволанцюгової ДНК. Тому ендонуклеази, що входять до складу системи, мають специфічну будову із двома ендонуклеазними сайтами. Під час потрапляння геному бактеріофагу або плазміди всередину бактеріальної клітини частина чужорідної ДНК може розпізнаватися продуктами CRISPR-асоційованих генів. Надалі чужинна ДНК піддається розрізанню, а невеликі нуклеотидні послідовності вбудовуються з-поміж коротких повторюваних послідовностей у CRISPR-локусі (етапи реалізації імунної відповіді проти ксеногенної ДНК та відмінності молекулярних механізмів захисту трьох різних типів CRISPR див. на рис. нижче). В майбутньому бактерія реагує на отримання чужорідної ДНК транскрипцією CRISPR-асоційованих генів та некодуючих послідовностей з цього локусу. Останні слугують провідниковими РНК-молекулами (CRISPR-RNA, crRNA / або single guide RNA, sgRNA, у разі якщо вона штучно створена науковцями для потреб геномної інженерії) і допомагають ендонуклеазам знаходити відповідні послідовності бактеріофагів та плазмід шляхом комплементарного зв’язування із ними. Слід відзначити, що на сьогодні CRISPR/Cas9 система виявлена у понад 40 % всіх бактерій та майже у 90 % відомих архей. На сьогодні вона широко використовується у так званому геномному редагуванні (genome editing). На відміну від технології рекомбінантних ДНК, такий підхід дозволяє здійснювати маніпуляції з генами безпосередньо в їхньому природному контексті – в геномі досліджуваного організму.

Згадана генетична система була описана Ishino et al. ще в 1987 році у E. coli, але перші переконливі докази щодо її участі у  формуванні резистентності до специфічних штамів бактеріофагів було отримано Barrangou та Horvath лише у 2007 році. Їм вдалося остаточно довести, що за резистентність до фагів відповідає саме унікальні, а не повторювані послідовності CRISPR-локусу. Причому, дослідження було виконано на важливому для харчової промисловості штамі Streptococcus thermophilus, а лише згодом з’ясувалося, що в кишковій паличці система працює аналогічним чином. Всього с тих пір було описано три типи CRISPR систем (див. рис. нижче), які головно різняться способом процесінгу (обробки) первинних транскриптів провідникової РНК, а також кількістю CRISPR-асоційованих генів, необхідних для виконання захисної функції. До слова, для цілей геномної інженерії наразі використовується система другого типу, що походить від згаданого вище S. thermophilus. Головною її перевагою порівняно із типами І та ІІІ є те, що для виконання ендонуклеазного розщеплення в ній задіяна лише одна ендонуклеаза – Cas9.

Типовий CRISPR/Cas9 локус в складі бактеріальної хромосоми побудований з CRISPR-асоційованих генів, що розташовані на 5’-кінці оперону і кодують функціональні протеїни системи. За ними розташовані короткі (30 нуклеотидів) прямі повтори, відокремлені один від одного так званою спейсерною ДНК (далі: спейсер) довжиною до 30-ти нуклеотидів. Як зазначено вище, спейсери відповідають специфічним послідовностям ДНК бактеріофагів, тобто по суті виконують функцію наведення системи на чужорідну ДНК. В свою чергу повторювані послідовності уможливлюють зв’язування провідникової РНК (в даному разі саме CRISPR-RNA, crRNA) із спеціальними білковими комплексами, які виконують ендонуклеазне розщеплення цільової ДНК. Під час біогенезу crRNA спеціальні РНКази розрізають поліцистронну РНК на сегменти, які складаються із одного спейсеру й однієї копії повторюваної послідовності. Останні повинні набути певної вторинної структури для правильної взаємодії із ендонуклеазними комплексами. В першому та третьому типах CRISPR повтори є інвертованими, тобто паліндроми. Хоча паліндроми в даному разі не є ідеальними, але достатніми для забезпечення вторинної структури у вигляді шпильки. В CRISPR/Cas9 системі S. thermophilus повторювані послідовності не містять паліндромів. Через це їх провідникова РНК потребує комплементарного зв’язування на 3’-кінці із допоміжною РНК молекулою trans-crRNA (tracrRNA), що експресується з іншого локусу. Частковий РНК дуплекс спочатку підлягає обмеженому процесінгу за участі РНкази ІІІ та інших досі не ідентифікованих факторів, а далі входить в ендонуклеазу Cas9. Дволанцюгова ділянка виконує функцію правильного орієнтування усього комплексу для успішного розрізання цільової ДНК молекули.

Порівняння механізмів резистентності до бактеріофагів CRISPR систем трьох типів

Порівняння механізмів резистентності до бактеріофагів CRISPR систем трьох типів. Структура типового CRISPR-локусу подана на горі. Експресія CRISPR-оперону веде до утворення функціональних протеїнових продуктів та некодучої РНК. Остання розрізається спеціальними РНКазами на індивідуальні crRNA, які несуть унікальну частину (позначено у кольорі) та повторювану частину (позначено сірим). Надалі повторювані послідовності утворюють характерні специфічні структури (шпильки у разі системи першого типу або часкові дуплекси trans-crRNA:crRNA у разі системи другого типу), що зумовлює їхнє входження до ендонуклеазних комплексів. Типи І та ІІІ покладаються на мультипротеїнові комплекси для розпізнавання та руйнування небажаної ДНК, тоді як в системі другого типу задіяна лише одна ендонуклеаза Cas9. В CRISPR першого типу білковий комплекс із crRNA (Cascade) є каталітично не активним і здійснює лише пошук цільової ДНК, після приєднання до якої відбувається залучення ендонуклеази Cas3 та розрізання послідовності. В третьому типі CRISPR crRNA може асоціюватися із Csm або Cmr комплексами, які виконують знешкодження ДНК та РНК цілей, відповідно. Остання система була ідентифікована у Pyrococcus furiosus та названа  CRISPR типу ІІІ-В. Джерело: Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell. Vol. 157, (June, 2014): 1262-1278.

Протеїн Cas9 специфічно розпізнає дволанцюгову ДНК і відповідно має два ендонуклеазні сайти: по одному для кожного з ланцюгів. Причому надважливою характеристикою Cas9 є те, що його здатність розпізнавати цільову ДНК жодним чином не пов’язана із амінокислотною послідовністю протеїну. І цим він принципово відрізняється від, наприклад, протеїнових доменів «цинкові пальці» (Zinc finger, Znf). Наведення на ціль здійснюється виключно за рахунок комплементарного зв’язування нуклеотидів спейсерної частини crRNA молекули із послідовністю ДНК. В серпні 2012 року в журналі Science було опубліковано роботу групи вчених під проводом Doudna J.A., в якій було продемонстровано здатність провідникової РНК та Cas9 утворювати активний ендонуклеазний комплекс in vitro. Докладно вивчивши структуру trans-crRNA:crRNA, вони змогли розробити синтетичну РНК молекулу, що успішно виконувала роль наведення ендонуклеазного комплексу на цільову ДНК. Важливо те, що їм вдалося об’єднати tracrRNA та crRNA в єдину молекулу (так звану guide RNA, sgRNA), в якій збережено тяж дволанцюгової РНК, критичний для правильного функціонування комплексу. Таким чином з’явилася можливість програмувати Cas9 на розрізання будь-якої послідовності ДНК, і в руках дослідників опинився досить потужний інструмент геномного редагування. Детальне дослідження комплексу показало, що для коректного розпізнавання 23-нуклеотидної цільової ділянки ДНК перед спейсером має міститись консенсусна послідовність так званого protospacer* adjacent motive (PAM) NCC:NGG, а для найбільш ефективного розрізання на 5’-кінець спейсеру має закінчуватися нуклеотидом G. По суті, це єдині обмеження щодо дизайну провідникової РНК, і в принципі Cas9 можна наводити на будь-яку послідовність типу GN20GG. Власне, розрізання цільової ДНК послідовності відбувається за три нуклеотиди до закінчення ділянки комплементарного зв’язування спейсеру.

Структура синтетичної провідникової РНК (guide RNA, gRNA) в комплексі із Cas9 нуклеазою та цільовою послідовністю ДНК.

Структура синтетичної провідникової РНК (single guide RNA, sgRNA) в комплексі із Cas9 нуклеазою та цільовою послідовністю ДНК. Подана структура експресійних векторів Cas9 гену та sgRNA, які були використані дослідницькою групою під керівництвом George M. Church для визначення ефективності геномного редагування (тут використовується скорочення sgRNA для позначення синтетичної провідникової РНК, щоб не плутати її із природною crRNA). Була здійснена трансфекція ліній клітин людини in vitro двома векторами: перший ніс послідовність Cas9, що включала в себе сигнал ядерної локалізації від вірусу SV40 та знаходилася під цитомегаловірусним промотором РНК-полімерази ІІ типу; другий вектор був розрахований на транскрипцію РНК-полімеразою ІІІ типу (U6 промотор) і містив послідовність sgRNA, 5’-частина якої відповідала за зв’язування із цільовою ДНК послідовністю (позначено зеленим), а 3’-частина – за утворення вторинної структури, необхідної для взаємодії із протеїном Cas9 (позначено блакитним), також була передбачена послідовність поліаденілування на 3’-кінці. Як бачимо, розпізнавання послідовності інтересу відбувається за двадцятьма трьома довільними нуклеотидами, при цьому важливими є послідовність безпосередньо прилегла до початку протоспейсеру* (PAM) та G нуклеотид на самому кінці протоспейсеру. Місця розрізання позначені ножицями – між третім і четвертим нуклеотидами від початку протоспейсеру. Джерело: Mali P., Yang L., Esvelt K.M., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. Vol. 339, (February, 2013): 823-826.

CRISPR/Cas9 система має очевидні переваги над своїми конкурентами по геномному редагуванню – нуклеазами із цинковими пальцями (zinc finger nucleases, ZFN) та TALE нуклеазами (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs). По-перше, вони передбачають стовідсоткову специфічність до сайту, яка забезпечується принципом компліментарності між азотистими основами, а не взаємодією амінокислотних залишків із ДНК. На початку 2013 року група того-таки Гарвардського Університету під керівництвом George M. Church порівняла ефективність геномного редагування за допомогою систем CRISPR/Cas9 та TALENs. Останні були значно менш успішними в цьому процесі, більше того, деякі локуси взагалі не могли бути модифікованими за допомогою TALENs. Виявилося, що модульна структура TALEN ендонуклеаз страждає від контекстуальних неточностей: нуклеотид-розпізнаючі домени, що розташовані поруч, перехресно впливають один на одного, тому специфічність розпізнавання індивідуального домену може залежати від його сусідів. Тим більше тонкі варіації внутрішньоклітинних умов можуть знижувати специфічність протеїново-нуклеотидних взаємодій. По-друге, РНК молекули легше синтезувати і доставляти в експериментальний об’єкт, будь то культура клітин in vitro або модельний організм in vivo. По суті, для почергового або навіть одночасного маніпулювання із генами**  у модельній системі потрібно виконати лише одну трансформацію – вставити в геном функціональну послідовність Cas9 гену із подальшим введенням відповідних crRNA молекул. Zhang et. al. Повідомили про ще простіший метод нокаутування генів, який взагалі не вимагає трансформації. Вони змогли досягти 80 % ефективності в отриманні нокаутних мишей лише ввівши до зиготи суміш з готового Cas9 протеїну та двох crRNA. Це значно заощаджує час дослідникові, що є дуже важливим фактором у сучасній науці. Після миші з’явилися відомості, що CRISPR/Cas9 система успішно працює на клітинах людини, даніо реріо, нематоди, а також на клітинах рису. Проте, незважаючи на очевидні переваги системи, досі нез’ясованими залишаються питання стосовно її точності та безпечності, особливо в світлі того, що сьогодні на CRISPR/Cas9 покладаються великі надії в сфері генної терапії різноманітних захворювань людини.

 

* Протоспейсером називають ділянку цільової ДНК, яка є безпосередньо комплементарна, власне, спейсеру – частині провідникової РНК.

** Серед можливих маніпуляцій із генами вирізняють: 1) повне видалення послідовності, тобто нокаут; 2) часткове видалення послідовності, 3) вставка певної послідовності та 4) заміна послідовності, тобто сайт-спрямований мутагенез прямо в геномі. Для успішного виконання усіх перерахованих генно-інженерних задач насамперед необхідно внесення двох сайт-специфічних дволанцюгових розривів ДНК в гені інтересу. В клітині існують дві системи виправлення дволанцюгових розривів. Стратегії (1) та (2) покладаються на систему негомологічного сполучення кінців (non-homological ends joining, NHEJ). Так як сайти розриву знаходяться поряд, то вони лігуються ензимами репарації із високою вірогідністю. При цьому втрачається послідовність, яка містилася між розривами. Таким чином можна досягнути обмеженого вкорочення гену (наприклад, видалити ділянку, яка кодує певний домен протеїну) або повного вилучення гену – класичний нокаут (conventional knockout). Стратегії (3) та (4) реалізуються шляхом гомологічної рекомбінації (homologous recombination, HR) із донорною ДНК молекулою. Такий шлях передбачає пошук ензимами репарації гомологічних послідовностей на сестринській хроматиді й використання її як матриці для заповнення прогалини. Але в даному разі на противагу сестринській хроматиді в клітину вводиться олігонуклеотид (дволанцюгова ДНК), який дослідник бажає вставити між дволанцюговими розривами. Послідовність інтересу з обох боків оточена ділянками гомології протяжністю 150-200 нуклеотидів кожна. Ензими репарації розпізнають її як гомологічну і переписують послідовність з нього на попередньо пошкоджений ген. Оскільки нуклеотид додається у надлишку, то існує досить висока вірогідність, що саме він, а не сестринська хроматида, буде використаний як матриця для синтезу. Таким чином можна здійснити як вставку нової функціональної послідовності гену (так званий knockin) або «вписати» мутації в існуючий ген (сайт-спрямований мутагенез).

Пов’язані публікації:

Застосування системи геномного редагування CRISPR/Cas9 для швидкого моделювання канцерогенезу

Читайте також: мікроРНК

Читати усі публікації за теґгами інженерія, редагування геному

<<назад до глосарію

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s