Застосування системи геномного редагування CRISPR/Cas9 для швидкого моделювання канцерогенезу

Канцерогенез – багатостадійний процес. В загальних рисах його поділяють на ініціацію, промоцію та прогресію. Кожний з етапів характеризується набуттям специфічних мутацій в генах, що відіграють ключову роль в розвитку пухлин, головно – прото-онкогенах та генах-супресорах пухлинного росту. Дослідження індивідуального внеску кожного з таких генів у «спільній справі», результатом якої є злоякісне новоутворення, є вкрай проблемним. На сьогодні існують дуже ефективні методи секвенування геному, настільки чутливі, що дозволяють визначати якісну та кількісну структуру генів окремої клітини. Такі методи активно застосовуються для дослідження гетерогенності популяції пухлинних клітин і є інформативними для вивчення пізніх стадій канцерогенезу. Проте, вони дають лише підсумкову картинку і не дозволяють прослідкувати історію мутацій і роль кожної з них на ранніх етапах неопластичної трансформації.

В наші дні з’явилася безпрецедентна можливість слідкувати за онкогенними мутаціями в режимі реального часу за допомогою…

В наші дні з’явилася безпрецедентна можливість слідкувати за онкогенними мутаціями в режимі реального часу за допомогою системи редагування геному CRISPR/Cas9. Вона складається із ДНК-специфічної ендонуклеази Cas9 та провідникової РНК (так званої single guide RNA, sgRNA). Остання виконує функцію наведення ендонуклеази на ген інтересу за принципом комплементарного зв’язування із його послідовністю. В результаті Cas9 вносить дволанцюговий розрив у цільовий ген, який надалі виправляється системою негомологічної рекомбінації еукаріотичної клітини. Такий неточний «ремонт» гену має наслідком внесення маленьких, почасти однонуклеотидних інсерцій/делецій (InDel), результатом чого є зсув рамки зчитування та нонсенс-опосередкований розпад мРНК (nonsense-mediated decay), що фактично означає нокаут цільового гену. В той же час, за умови внесення до клітини так званої донорної послідовності, можна досягнути репарації дволанцюгового розриву системою гомологічної рекомбінації, і це в свою чергу дозволяє здійснювати сайт-спрямований мутагенез. Детальніше про CRISPR/Cas9 систему можна прочитати в новому розділі блогу під назвою «Глосарій».

Отож, восени 2014 року одразу дві групи вчених Массачусетського Технологічного Інституту незалежно розробили підходи до моделювання розвитку раку легенів на мишачій моделі in vivo за  допомогою CRISPR/Cas9. Так, вчені під проводом Tyler Jacks використали раніше виведені лінії трансгенних мишей і доповнили цю модель Cas9-опосередкованим нокаутом, що дозволило їм порівняти ефекти від втрати різних генів-супресорів пухлинного росту. Інша дослідницька група під керівництвом Feng Zhang розробила абсолютно нову трансгенну мишу, яка здатна експресувати Cas9 ендонуклеазу і потребує лише введення провідникових РНК (sgRNA). За її допомогою їм вдалося здійснити не лише вимкнення генів-супресорів пухлинного росту, а й внести специфічні активуючі мутації в послідовності прото-онкогену. По суті, така експериментальна система може використовуватися для швидкого моделювання будь-якого генетичного захворювання, не лише раку.

Основною перевагою такого підходу є швидкість отримання результату. Раніше на виведення трансгенної миші для вивчення певної генетичної аномалії йшов щонайменше один рік. Процедура складалася з трансформації однієї з клітин п’ятириденного ембріону миші (бластоцисти), селекції клітин на спеціальному середовищі із подальшим «підсадженням» трасформованої клітини назад до ембріону, вирощування химерної миші (важливо, щоб трансформована клітина ембріону дала початок так званим попередникам статевих клітин, інакше процес трасформації та вирощування слід було повторювати спочатку) та інбредного схрещуювання химерних мишей для отримання індивідів, гомозиготних за вставкою. Використання Cas9 та sgRNA не лише спрощує цей метод, знімаючи необхідність отримання трансгенних мишей, але й у поєднанні із методами секвенування наступного покоління (next generation sequencing) робить можливим аналіз наслідків мутагенезу в окремих соматичних клітинах. До слова, соматичний мутагенез вважається саме тим процесом, який, власне, і призводить до розвитку пухлин за природних умов. Це ще більше наближує експериментальну систему до реальних обставин.

А тепер докладніше про кожен з експериментів массачусетських вчених. Отже, в першому випадку для моделювання раку легенів було обрано два типи трансгенних мишей – увага на схему експерименту, подану нижче. Кожна з них мала так звану knockin алель для увімкнення експресії онкогену Kras, мутованого за дванадцятим амінокислотним положенням – G12D (позначається як KrasG12D/+). До того ж одна з мишачих ліній (на рисунку зображена праворуч) додатково несла так звані «флоксовані» алелі гену TP53, що кодує усім відомий ген-супресор пухлинного росту p53 (позначається як TP53fl/fl). Увімкнення експресії онкогену KrasG12D/+ – власне, його knockin* – рівно як і одночасний нокаут гену у «флоксованій» лінії мишей відбувається у разі експресії в тканинах гризунів Cre-рекомбінази. Цей ензим розпізнає інвертовані loxP** послідовності, якими обрамлені стоп-сигнал перед онкогеном KrasG12D/+ і ціла послідовність гену TP53. Надалі Cre вирізає ці елементи з геному миші. Таким чином знімається блокування з транскрипції KrasG12D/+, і в клітині з’являється його білковий продукт – мутований онкогенний протеїн. На додачу втрачається експресія супресора p53, якщо це передбачено в піддослідній тварині.


* штучне слово, яке неможливо перекласти, придумане американcькими вченими для позначення феномену, за суттю протилежного нокауту,  knockout

** «флоксловані» – це ще одне сленгове слово, яке походить від скорочення flanked with loxP – fl – floxed


Генетичні характеристики піддослідних мишей, які використовувалися в експерименті

Генетичні характеристики піддослідних мишей, які використовувалися в експерименті. Перший варіант (ліворуч) містив лише конструкцію для knockin-експресії онкогену KrasG12D/+. Другий варіант (праворуч) ніс ідентичну конструкцію і додатково був обладнаний модифікованим геном-супресором пухлинного росту TP53, що уможливлювало нокаут останнього. Подробиці промотерів та послідовностей поліаденілування не вказані. Структура, яка знаходиться поміж промотером та геном – loxP-STOP-loxP, забезпечує гальмування транскрипції, яке знімається шляхом активації Cre рекомбінази в клітині.

Така експериментальна модель дозволяє вивчати взаємодію лише двох канцерогенних мутацій – G12D в прото-онкогені Kras та інактивуючі мутації TP53. Для того, щоб розширити можливості цієї модельної системи і уможливити внесення додаткових мутації в інші гени-супресори, головно NK2 homeobox 1 (Nkx2-1), phosphatase and tensin homologue (Pten) та adenomatous polyposis coli (Apc), Jacks і колеги розробили спеціальний лентівірусний вектор. В його структуру (увага на малюнок нижче) вчені включили послідовності sgRNA до одного із зазначених вище генів-супресорів, а також гени ендонуклеази Cas9 та Cre рекомбінази в одній рамці зчитування. Кожну з функціональних послідовностей вони обладнали сильним промотером для активної експресії. Вірус вводили до трахеї мишей за допомогою довгого катетора. Через десять тижнів мишей забивали і дослджували утворення пухлин в легенях за допомогою методів імуногістохімії та секвенування ДНК.

Схема експерименту та структура вектору для нокаутування генівсупресорів. Лентівірусний вектор несе послідовність провідникової РНК (sgRNA) до одного з трьох генів Nkx2-1, Pten, або Apc, яка розташована під сильним промотером для РНК полімерази ІІІ типу (U6). За нею слідує послідовності Cas9 ендонуклеази та Cre рекомбінази під одним промотером під назвою EFS (короткий промотер фактора елонгації 1α, elongation factor 1α short). Після трансляції на рибосомі дипротеїн саморозщеплюється на складові частини за допомогою вбудованої в нього 2А послідовності (в природі така послідовність зустрічається в геномі певних пікорновірусів). Цікаво, що в даному разі не використовувалися репортерні гени для оцінки експресії в клітинах.

Відтак, в розпорядженні вчених за лічені тижні опинилися піддослідні миші аж семи різних фенотипів (#1 контрольні KrasG12D/+, #2 KrasG12D/+, Nkx2-1–/– , #3 KrasG12D/+, TP53–/–, Nkx2-1–/–, #4 KrasG12D/+ , Pten–/–, #5 KrasG12D/+, TP53–/–, Pten–/–, #6 KrasG12D/+, Apc–/–, #7 KrasG12D/+, TP53–/–, Apc–/–), які можна було паралельно досліджувати і порівнювати між собою на предмет особливостей злоякісного переродження епітелію легенів. У мишей із Cas9-опосередкованим нокаутом Nkx2-1 та Pten було виявлено характерні для таких мутацій порушення. Наприклад, у Nkx2-1–/– мишей значно збільшувалася продукція муцинів епітеліальними клітинами альвеол, вони характеризувалися високим ступенем дедиференціації та помірними темпами проліферації. У разі нокауту Pten спостерігалося збільшення рівня активованих (фосфорильованих) форм серин/треонінових кіназ PI3K та Akt. Цікаво, що одночасна відсутність експресії PTEN та p53 призводила до значної акселерації клітинних поділів і розростання пухлинної маси. В свою чергу втрата гену Apc, що, до речі, ніколи до цього не досліджувалася в аденокарциномі легенів, викликала значно більш виражену гіперплазію та дедиференціацію у разі одночасного нокауту із TP53. Секвенування тканин легені виявило значну кількість одно- та двонуклеотидних інсерцій/делецій, що вказувало на переважний нокаут шляхом нонсенс-опосередкованого розпаду мРНК, причому ефективність одно- та двоалельного нокауту досягала 68 %.

Перед тим як перейти до розгляду другої стратегії, слід зазначити, що її розробив корифей дослідження геномного редагування CRISPR/Cas9 – Feng Zhang. Його ідея полягала в тому, щоб обладнати мишу геном Cas9, який можна ввімкнути шляхом knockin (див. вище). По суті, достатньо лише доставити потрібні sgRNA в певні тканини миші із активованою експресією Cas9 для того, щоб виконати нокаут цільових генів. Це заощаджує місце у генетичному човнику, і дозволяє працювати із значно ширшим спектром векторів без огляду на їх ємність. Але найцікавіше, що такий підхід додає нові тонкощі в налаштування експериментальної системи: можна досягнути тканино-специфічної (або специфічної до певного періоду онтогенезу) експресії ендонуклеази Cas9, а разом із тим – нокауту цільових генів. Для цього достатньо схрестити неактивну Cas9-мишу із мишею, що несе ген Cre під відповідним тканино- або часо-специфічним промотером. У нащадків від такого схрещування експресія ендонуклеази Cas9 спостерігатиметься лише у тканинах, де буде активна Cre рекомбіназа. На рисунку нижче детально розглянуто генетичну конструкцію, якою модифіковано мишу.

Структура вектора для експресії ДНК-ендонуклеази Cas9 в клітинах миші. Конструкція обрамлена сайтами гомології (Left arm/Right arm) для вбудовування у пермісивний локус миші під назвою Rosa26 для постійної (конститутивної) експресії. Місця передбаченої рекомбінації позначені штрихованими лініями. Те, що знаходиться за межами правого сайту гомології – це маркер негативної селекції, який дозволяє відсіяти клітини із неспецифічною вставкою, що відбувалася не в Rosa26 локус. В даному разі використовується ген дифтерійного токсину А (DTA). Експресійна касета Cas9 протеїну обладнана сильним синтетичним трикомпонентним промотером CAG (cytomegalovirus early enhancer element, promoter part of chicken beta-actin gene, splice acceptor of the rabbit beta-globin gene) і сигналом поліаденілування бичачого ростового гормону (bovine growth hormone polyadenylation, bGHpA). Подібно до описаного вище knockin механізму, між промотером та функціональною послідовністю розташований loxP-STOP-loxP (LSL) елемент. Експресійна касета містить два гени, розділені вже відомим вам саморозщеплюючим пептидом пікорновіруса P2A: перший ген кодує, власне, Cas9 ендонуклеазу, а другий є репортерним геном – посиленим зеленим флуоресцентним протеїном (enhanced green fluorescent protein, EGFP). Касета також містить додаткові елементи. Зокрема на 3’-кінці перед сигналом поліаденілування міститься woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory elemet (WPRE). Його послідовність на 3’-нетрансльованій області мРНК відповідає за кращу стабільність молекули в цитоплазмі, а відтак – за більший вихід білкового продукту. На 5’-кінці касети стоїть так звана теґова послідовність 3xFLAG, що уможливлює аналіз експресії Cas9 протеїну за допомогою специфічних антитіл. Позитивний (Neo) та негативний (DTA) селективні маркери обладнані промотерами та сигналами поліаденілування, запозиченими від гену із високим рівнем експресії, що кодує ензим гліколізу – фосфогліцераткіназу (PGK).

Варто зазначити, що всі фізіологічні показники миші із активним Cas9 були в нормі, випадкових порушень геному не спостерігалося навіть в найбільш чутливих до цього клітинах – пірамідальних нейронах. Проте, для моделювання раку легенів вчені все-таки вирішили активувати ендонуклеазу Cas9 шляхом введення вектору, що містив Cre рекомбіназу, а не шляхом схрещування із Cre+ мишою. Тож, дизайн експерименту цілком нагадував той, що використовували їхні «колеги по цеху», щоправда, Zhang більше вподобав аденовірус-асоційований вектор 9 (AAV9), а не лентівірус, для доставки генетичної конструкції в епітеліоцити легенів. Вчені відзначали достатньо високий рівень специфічності виникнення очікуваних мутацій саме в зазначених клітинах. Загалом, вектор був розрахований на одночасне виконання нокауту двох генів-супресорів пухлинного росту (TP53 та Lkb1) та внесення сайт-специфічної мутації в прото-онкоген Kras (тієї самої G12D). Для реалізації цієї задачі AAV9 вектор містив три послідовності sgRNA (відповідно, sgKras, sgp53 та sgLkb1), ген Cre рекомбінази, репортерний ген (люцифераза Renilla reniformis, Rluc) та послідовність для гомологічного виправлення пошкодженого гену Kras із заздалегідь внесеною мутацією. Структуру вектора та його детальний опис подано на рисунку нижче.

Схема експерименту та структура вектору для нокаутування генів-супресорів та сайт-спрямованого мутагенезу прото-онкогену Kras. Аденовірус-асоційований вектор 9 (AAV9) для тимчасової експресії одночасно несе послідовності провідникової РНК (sgRNA) до трьох генів: двох генів-супресорів пухлинного росту TP53, Lkb1 та одного прото-онкогену Kras (зеленими стрілками позначені U6 промотери і червоними прямокутниками – послідовності відповідних sgRNA). Провідникові РНК до генів-супресорів розраховані для нокаутування останніх, тоді як sgKras-опосередковане пошкодження послідовності прото-онкогену розраховане на його виправлення шляхом гомологічної рекомбінації із відповідною послідовністю вектора (позначена фіолетовим) – так званою донорною послідовністю, в яку «вписана» потрібна мутація (в даному разі амінокислотна заміна G –> D в 12-му положенні прото-онкогену). Так здійснюється сайт-специфічний мутагенез за допомогою Cas9. Експресійна касета для репортерного гену (Rluc) та Cre рекомбінази побудована подібно до описаних вище варіантів генетичних конструкцій. ITR – вірусні інвертовані термінальні повтори, що забезпечують реплікацію генетичного вектора в ядрі еукаріотичної клітини.

Після трахеального введення мутагенного вірусу в мишу, дослідники дали 9-ти тижнів для увімкнення Cas9 ендонуклеази та розвитку пухлин в легенях. У кінці терміну були проведені рентгенологічний, гістопатологічний та молекулярний аналізи. Зокрема, за допомогою секвенування ДНК було встановлено, що успішна трансформація та подальше геномне редагування мало місце в 1,8 % початкової кількості клітин, якщо брати за ціле увесь об’єм легеневих тканин. Більшість мутацій, як і в попередньому експерименті, являли собою інсерції/делеції із зсувом рамки зчитування. Із тою самою частотою з’являлася також очікувана однонуклеотидна заміна (single nucleotide polymorphism, SNP) в гені Kras – G12D. Рентгенологічний аналіз за допомогою мікро-комп’ютерного сканування (μCT) дозволило виявити наявність численних мікровузликів (micronodules) фокального пухлинного росту. Цікаво, що розміри таких утворень значно варіювали в межах легенів однієї миші, що вказувало на неперервну множинну ініціацію канцерогенезу в тканинах піддослідної тварини. В деяких мишей сукупний розмір злоякісних новоутворень перевищував 10 % об’єму самих легенів. Гістопатологічне типування методами рутинного забарвлення гематоксиліном/еозином та імуногістохімії показало, що пухлини в основному походять від пневмоцитів ІІ типу – тих самих, які задіяні у патогенезі раку легенів людини. Також було доведено, що геномне редагування призвело до виникнення цілої низки пухлин від І-ІІ стадій бронхіо-альвеолярних аденом до IV стадії інвазивних аденокарцином.

У підсумку, маємо дві повноцінні стратегії геномного редагування для моделювання практично будь-якої генетично зумовленої недуги людини. Обидві вони засновані на активності бактеріальної ДНК-ендонуклеази Cas9, яка останнім часом стала найгарячішою темою в галузі генетичної інженерії. Насправді, кількість публікацій зі використанням цієї системи маніпулювання генами у найвпливовіших світових біологічних журналах в період 2013-2014 років зростає із геометричною прогресією. Зважаючи на, без перебільшення, революційність Cas9 для молекулярної біології, а також неймовірну увагу наукової спільноти до неї, найближчим часом слід очікувати нових приголомшливих відкриттів, які просто були неможливі раніше. До речі, одним з потенційних застосувань Cas9-редагування є генна терапія ВІЛ/СНІДу. Дізнатися більше ви можете на сторінках сайту-партнеру Моя Наука, перейшовши за посиланням:

Де не справляється людська – справиться бактеріальна імунна система: Можливості застосування CRISPR/Cas9 для генної терапії вірусу імунодефіциту людини

Посилання

Sanchez-Rivera F.J., Papagiannakopoulos T., Romero R., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. Vol. 516, No. 7531 (December, 2014): 428 – 431.

Platt R.J., Chen S., Zhou Y., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. Vol. 159, No. 2 (October, 2014): 440 – 455.

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s