Українська протиракова вакцина на марші

На написання цієї статті мене підштовхнув новинний сюжет, який нещодавно з’явився у Фактах ICTV. В ньому розповідається про передову розробку українських вчених в галузі імунотерапії раку, що допомагає подовжити період безрецедивного виживання пацієнтів після хірургічного видалення пухлини. Наразі я пропоную переглянути сюжет, а далі перейти до безпосереднього обговорення того, що, власне, відбувається на молекулярному та клітинному рівні:

Насамперед, виникає закономірне питання чи існує взагалі принципова можливість лікування раку використовуючи ресурс імунної системи пацієнта, позаяк пухлина не є чужорідним патогеном, як, наприклад, бактерія чи вірус. Пухлина складається з тих самих, хіба що трохи видозмінених, клітинних та міжклітинних елементів тканини, з якої походить. Якщо б імунна система людини була б здатна ефективно виявляти і знешкоджувати пухлини, то рак повинен був би виліковуватися сам собою, чи не так? Виявляється, що відповідь на це питання – ствердна. Такий феномен неодноразово фіксувалися впродовж історії медичної науки, йому навіть дали окрему назву – спонтанна регресія пухлини. Його вивченню в київському Інституті патології та онкології присвятив найкращі роки свого життя Ростислав Євгенович Кавецький, щоправда він застосовува інший термін – антиканцерогенез (а інститут сьогодні носить його ім’я – ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького). Пізніше у 70-80 рр. американець Hewitt та бельгієць Boon досліджували можливості імунного відторгнення пухлин на мишачій моделі раку. Результатом їхнього наукового пошуку стало підтвердження тої-таки принципової можливості контролю пухлинного росту з боку імунної системи, а саме цитотоксичними Т-лімфоцитами (CTL) також знаними як Т-кілери.

 

Як працюють Т-кілери та дендритні клітини

А зараз трішечки імунології. CTL – це спеціалізовані клітини імунної системи, які виконують пошук та знищення клітин організму, що містять нетипові елементи в цитоплазмі (зазвичай ними є вірусні білки). Знаходити «несправні клітини» Т-кілерам допомагають поверхневі рецептори, зокрема Т-клітинний рецептор (TCR) та його корецептор CD8. За експресію останнього CTL також називають CD8+ Т-клітинами. Цим вони відрізняються від інших Т-клітин, зокрема Т-хелперів, які експресують інший поверхневий маркер – CD4. Знаходячи клітину, яка демонструє ознаки ураження чи пошкодження, Т-кілер прикріплюється до неї використовуючи свої рецептори і викидає поряд із нею перфорини та гранзими – спеціальні протеїни, які вбивають нездорову клітину. Перфорини відповідають за утворення отворів у цитоплазматичній мембрані, а гранзими є протеазами, які потрапляють у цитоплазму, активують каспази і запускають шляхи апоптозу. Як саме цитотоксичний Т-лімфоцит відрізняє нормальні клітини від «хворих»? Більшість клітин в нашому організмі експресують на своїй поверхні спеціальні білки під назвою головний комплекс гістосумісності (major histocompatibility complex – MHC), які слугують для представлення внутрішньоклітинних білків на догляд Т-кілерам – процес, який називається «презентація антигену».

Подібно до того, як люди вчаться, щоб здобути фах, Т-кілери проходять попередню підготовку, щоб розрізняти свої та чужі антигени. Якщо продовжувати аналогію, існують також  тренери Т-кілерів – антиген-презентуючі клітини, чиї функції полягають у захоплені і презентуванні антигенів Т-клітинам. Ось тут на передній план виходять згадувані у сюжеті дендритні клітини (ДК) (від грецького δένδρον – дерево; ці клітини мають зірчасту форму, численні вигини допомагають збільшити площу поверхні цитоплазматичної мембрани для максимально ефективної взаємодії із багатьма Т-клітинами одночасно). Дещо дотепно звучить фраза диктора сюжету, про те, що ДК були відкриті три роки тому американськими вченими. Насправді вони були відкриті Ральфом Штайманом ще у 1973 році, а три роки тому він отримав за цей доробок Нобелевську Премію з фізіології та медицини. Сталось так, що навіть існування дендритних клітин було предметом дискусії до останнього часу. Це було настількими гарячою та обговорюваною темою, що науковці, які змогли поставити остаточну крапку в цій історії, були удостоєні такої високої нагороди разом із першовідкривачем цих клітин. Тож, ДК є інтегральною ланкою імунітету, перетворюючи ранню неспецифічну реакцію на пізню специфічну, адже вони показують Т- та В-клітинам що саме треба атакувати. Коли Т-клітинний рецептор розпізнає антиген презентований у складі MHC I дендритної клітини відбувається активація Т-кілера – приведення його у «бойову форму». Активація реалізується шляхом додаткових взаємодій між поверхневими білками Т-клітини та ДК (зокрема CD80, CD70 та 1-4BBL), а також за рахунок синтезу останніми стимулюючих цитокінів IL-2, IL-12, IL-15 та XCR1.  Отже, саме дендритні клітини керують специфічною відповіддю спрямованою проти конкретного антигену.

 

Пухлинні антигени

Якщо існуює протипухлинна імунна відповідь, значить злоякісні клітини експресують певні антигени, що сприймаються імунною системою як небезпечні. Окремий випадок являють вірус-індуковані пухлини, де таким антигеном є фрагменти вірусних білків, але ми зосередимось на інших прикладах. Пухлино-специфічні антигени умовно поділяють на високоспецифічні та низькоспецифічні. До перших належать продукти аномальної генної експресії, характерні для перероджених клітин. Такі продукти можуть з’являтися у клітині раку внаслідок двох основних процесів, які є наслідком нестабільності її геному: мутацій та порушень профілю транскрипції генів внаслідок епігенетичних змін. Щодо мутацій, то найчастіше це точкові мутації, які мають наслідком зміну однієї амінокислоти у певному протеїні. Коли мутований пептид завантажується на MHC молекулу, імунна клітина може розпізнати його як чужорідний. Також бувають випадки, коли мутації є більш широкомасштабними і призводять до появи протяжних мутованих ділянок у протеїнах. Так, у наслідок хромосомних транслокацій у цитоплазмі з’являються химерні протеїни, у разі мутацій стоп-кодонів або сайтів галуження (сплайсінг) можуть транслюватися подовжені протеїни або прочитуватися інтрони генів, відповідно. Більшість таких мутацій є супутніми (passenger mutations) і не впливають на агресивність пухлини, тому злоякісні клітини, що їх несуть, швидко піддаються «природному добору» у процесі, знаному як імунна селекція раку (cancer immunoediting). Але існують мутації, що безпосередньо відповідають за успішність розмноження перероджених клітин, такі як точкові мутації циклін-залежної кінази 4 (CDK4), подовження рамки зчитування гену каспази 8 (CASP8) внаслідок мутації стоп-кодону та химерний онкоген Bcr-Abl. Що стосується епігенетичних змін, то для деяких злоякісних новоутворень є характерним певний ступінь дедиференціації із набуттям більш відкритої форми хроматину внаслідок змін у профілях метилування ДНК та повернення до бівалентного стану модифікацій гістонів. Через це в клітинах раку може початись транскрипція генів раннього ембріогенезу, які не є характерними для дорослого організму і можуть також бути розпізнані як чужорідні антигени. Такі гени входять до категорії раково-ембріональних антигенів, серед них меланома-асоційований антиген (MAGE), раково-тестикулярний антиген (CTAGE), та ін. (про низькоспецифічні ракові антигени я змовчу за браком місця). Таким чином, імунна система має можливість контролювати цілісність та правильність функціонування геному клітини.

 

 

Чому не виникає імунітет проти пухлини

Але у чому тоді полягає проблема реалізації природної імунної відповіді проти раку? Перш за все слід відзначити, що поряд із специфічністю антигену існує також інша дуже важлива характеристика – його імуногенність – сила рекції на нього з боку імунної системи. Річ у тім, що система нашого природного захисту еволюційно загострена на протидію зовнішнім патогенам – вірусам, бактеріям, паразитам, тощо. Тому їхні антигени є набагато більш імуногенними, ніж навіть високоспецифічні пухлинні антигени. Іншою причиною неефективності імунної відповіді проти раку є те, що навколо солідної (наголос на перший склад) пухлини як правило утворюється так зване імуносупресорне мікрооточення, в якому імунна система просто не здатна функціонувати. Таке оточення виникає внаслідок хронічного запалення, що супроводжує пухлинну хворобу і веде до порушення комунікації між різними клітинами імунної системи. Більше того, пухлини можуть активно втручатися в координацію імунної відповіді, викидаючи до оточення різноманітні стимулюючі молекули. Дендритні клітини самі стають заручниками такої «несприятливої атмосфери» і перебуваючи поряд із пухлиною не можуть ефективно допомагати цитотоксичним Т-лімфоцитам у знищенні раку, а навпаки сприяють активнішому росту пухлини (див. рис. нижче). До речі, на противагу солідним (наголос на перший склад) пухлинам, у разі гемобластозів, які характеризуються відсутністю чітко оформлених пухлинних осередків, а відтак не мають  імуносупресорного мікрооточення, імунотерапія є набагато більш ефективною. Зокрема наразі певний успіх продемонструвало використання Т-кілерів спрямованих проти CD19 – поверхневого маркеру клітин гострої лімфобластної лейкемії. У підсумку, низька імуногенність пухлинних антигенів та імуносупресорне мікрооточення роблять природний протипухлинний імунітет неефективним.

Порушення функцій дендритної клітини під впливом пухлинного мікрооточення. Злоякісні пухлини здатні залучати дендритні клітини через секрецію хемокінів таких як CCL20 та CXCL12. Надалі ДК можуть потрапляти під вплив сигнальних молекул, що виділяють злоякісні клітини, зокрема тимічного стромального лімфопоетину (thymic stromal lymphopoietin – TSLP). Цей фактор впливає на комунікацію між дендритними та Т-клітинами і порушує диференціювання останніх. Таким чином Т-клітини замість атаки на пухлину починають продукувати інтерлейкін 13, який може активувати пухлинний ріст напряму або опосередковано через пухлино-асоційований макрофаг (tumor associated macrophage – TAM). EGF – епідермальний фактор росту.

 

Навантаження дендритних клітин антигеном ex vivo

У того, хто героїчно дочитав до цього місця, вже має з’явитися розуміння того, яким чином можна виправити ситуацію: потрібно «наполегливо показати» дендритній клітині пухлинний антиген, щоб вона могла «змусити» Т-кілери виконувати свою роботу. На жаль, я не володію текстами публікацій, які б описували процедуру приготування української протипухлинної вакцини та конкретні результати її застосування (можливо хтось з моїх уважних читачів допоможе мені їх відшукати, залишивши посилання у коментарях), тож доведеться робити висновки з тексту приведеного вище новинного сюжету. Отже, після хірургічного видалення пухлини у хворого забирають периферичну кров. Далі з препарату крові отримують дендритні клітини (очевидно, за допомогою методу флуоресцентно-активованого сортування клітин – FACS). Потім отримані ДК «запаюють в ампулу» із пост-операційним патологічним матеріалом (скоріше за все йдеться про так званий пухлинний лізат, а не про цілу пухлину) і лишають так на якийсь час. Нарешті, оброблені таким чином ДК повертають пацієнту, де вони мають по ідеї стимулювати імунну відповідь проти решток пухлини. Загалом, така процедура відома під назвою «навантаження антигеном ex vivo» (ex vivo в даному випадку означає, що частина процедури проводиться in vivo, а частина – in vitro). Слід також відзначити, що ця процедура зазвичай проводиться із додаванням імуностимулюючих сполук, так званих ад’ювантів. Як правило це частини бактерій та вірусів, які «подразнюють» дендритні клітини і «заохочують» їх активніше поглинати і обробляти пухлинні антигени. Прикладами таких сполук є poly I:C, ліпополісахариди, флагелін та ін.. Препарати із таким принципом дії вже існують. Зокрема у Сполучених Штатах вдало пройшов клінічні випробування і наразі застосовується у клініці препарат під назвою sipuleucel‑T. Він являє собою активовані ДК, які розпізнають антиген злоякісного раку передміхурової залози Prostatic acid phosphatase (PAP), і підвищує середній рівень трирічної виживаності серед пацієнтів на 31,7 %. Тож, подібний підхід дійсно може призвести до певної стимуляції протипухлинної відповіді з боку імунної системи, проте він має кілька суттєвих недоліків.

Механізм запуску протипухлинного імунітету активованими дендритними клітинами. Кінцевою метою вакцин на основі ДК є активація цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL) і їхнього спрямування  проти пухлини. Цей процес може проходити двома шляхами: (1) тренуванням (Priming) так званих “наївних” Т-клітини, які ще ніколи не стикалися із пухлинними антигенами, (2) перепрограмуванням (Reprogramming) Т-кілерів, які вже “знають” пухлинні антигени, але знаходяться у загальмованому стані через імуносупресорне мікрооточення (такі Т-клітин зустрічаються прямо з-поміж ракових клітин і називаються пухлино-інфільтруючі лімфоцити; вони були відкриті Yron та Wood у 1980 році і відтоді слугували доказом того, що імунна система як-не-як намагається боротися із пухлиною).

 

Проблеми імунотерапії пухлин та шляхи її вдосконалення

Наразі імунотерапія стикається зі двома основними проблемами фундаментального характеру. По-перше, вона не знімає питання імуносупресорного мікрооточення. Якщо дендритна клітина або Т-кілер, навіть будучи штучно активованими, опиняються у несприятливому пухлинному оточенні, вони можуть «відмовитися» працювати, отримуючи суперечливі команди внаслідок вищезгаданого порушення комунікації між імунними елементами. По-друге, певне занепокоєння викликає застосування лізатів цілої аутологічної пухлини. З одного боку такий підхід дозволяє якнайширше «ознайомити» дендритні клітини із антигенами конкретної пухлини, вилученої у пацієнта, але з іншого боку частина ДК поглине і надалі презентує Т-кілерам абсолютно нормальні антигени. Здоровий глузд підказує, що ймовірність другої події буде набагато вищою, оскільки мутації у злоякісних клітинах – події поодинокі (див. Пухлинні антигени). У кращому випадку цитотоксичні Т-лімфоцити, що були активовані нешкідливими антигенами, будуть загальмовані, власне, імунною системою пацієнта (феномен під назвою «анергія»), і ефект такої терапії буде нульовим (оскільки кількість решти ДК, які презентуватимуть «потрібні» антигени, буде мізерною, і Т-клітини в організмі пацієнта можуть з ними ніколи «не зустрітися»). У гіршому випадку, презентуючи власні антигени, дендритні клітини можуть спровокувати Т-клітини до нападу на тканини свого ж організму, що відбувається під час так званих аутоімунних захворювань, і це може призвести до різкого погіршення стану пацієнта. Можливо ви помітили, що на відміну від української протиракової вакцини, де використовується якраз-таки лізат цілої пухлини, американська розробка спрямовує імунну відповідь проти одного визначеного антигену, обрання якого ґрунтувалося на результатах численних попередніх досліджень. І це наводить на певні роздуми… Отже, специфічне націлювання імунних клітин проти певної поверхневої детермінанти злоякісних клітин може суттєво підвищити ефективність імунотерапії і дійсно подовжити життя пацієнта. Проте, на жаль, для більшості пухлин специфічні антигени досі не визначені. Ситуацію ускладнює й те, що пухлинна хвороба має абсолютно індивідуальні характеристики у кожного пацієнта. На сьогодні, як ніколи актуальними залишаються питання персоналізації імунотерапії. Слід зазначити, що наразі вже існують молекулярно-біологічні методи придатні для виконання такого роду задачі. Йдеться в першу чергу про методи секвенування наступного покоління (next generation sequencing), використання яких теоретично дозволить розробляти вакцин на основі дендритних клітин проти будь-якої неоплазії і для усіх без винятку пацієнтів. На останок зазначу, що подібні дослідження вже ведуться, і про їх перебіг і результати я сподіваюся повідомити вам найближчим часом на сторінках свого блогу.

 

Посилання:

Palucka K., Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. NATURE REVIEWS | CANCER. Vol. 12, (April 2012): 265-277.

Palucka K., Banchereau J. Dendritic-Cell-Based Therapeutic Cancer Vaccines. Immunity. Vol. 39, (July 2013): 38-48

Coulie P.G., Van den Eynde B.J., van der Bruggen P., Boon T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: at the core of cancer immunotherapy. NATURE REVIEWS | CANCER. Vol. 14, (February 2014): 135-146.

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s