Епічна битва: Сибірська виразка проти раку

Зазвичай, коли у дослідника бракує уяви щось придумати самотужки, він звертається за порадою до наймогутнішого інженера у всесвіті – до природи. Саме цю ключову істину ілюструє нам дана дослідницька історія. В терапії злоякісних новоутворень є прогалина, яку ще нікому не вдалося заповнити – «адресна доставка» терапевтичної речовини до клітини раку. Успіх таргетної трапії (недоліки якої ми мали можливість обговорювати раніше) зумовлений насамперед тим, що активана молекула діє у рази ефективніше саме у перероджених клітинах. Але разом із тим вона потрапляє до здорових тканин організму, де може спричинювати неспецифічні ефекти терапії (так звані off-target effects, термін запозичений з досліджень РНК інтерференції), які варіюють у широких межах в залежності від типу препарату та індивідуальних особливостей пацієнта. Тому цілеспрямована доставка протиракових агентів є “святим граалем” сучасної молекулярної онкології. Десятиліттями вчені намагалися вирішити цю проблему. Спочатку надії покладали на ліпосоми. Вони хоч і були доволі ефективними для перекидання терапевтичних молекул через цитоплазматичну мембрану, і навіть могли бути прицільно спрямовані шляхом кон’югації антитіл, проте виявляли потужний гепатотоксичний вплив на експериментальних моделях in vivo, тому вони навіть не дійшли до стадії клінічних випробувань. Були також подібні розробки, які оминали використання ліпосом (полімерні та композитні наночастки, пенетруючі пептиди, трансактиватор транскрипції вірусу імунодефіциту людини, це лише неповний перелік), але вірогідність подолання цитоплазматичного бар’єру терапевтичною молекулою в такому разі значно зменшувалася.

Bacillus anthracis – є грам-позитивною бактерією, збудником небезпечної хвороби під назвою сибірська виразка. Смертельність зазначеного захворювання завдячує еволюційно відточеному механізму впорскування летальних токсинів всередину еукаріотичної клітини. Антракс-токсин є класичною двокомпонентою системою (іншими прикладами є токсини Clostridium tetani та Corynebacterium diphtheriae): перша компонента відповідає за утворення отвору в мембрані клітини ссавця, друга – за порушення гомеостазу клітини. Функцію першої компоненти антракс-токсину виконує пороутворюючий протеїн PA (protective antigen), роль другої компоненти відіграють два протеїни: летальний фактор (LF) те едема-фактор (EF) (едема – набряк) (процес зображено на рисунку нижче). LF є протеазою, специфічною до MAP-кіназ, і призводить до зупинки цього сигнального каскаду, що є ключовим у вживанні, розмноженні та русі клітин імунної системи. EF є кальмодулін-залежною аденілатциклазою, діяльність якої виводить з ладу сигнальні шляхи cAMP, що производить до розладу роботи K/Na-АТФаз, порушення водно-сольового обміну та, як наслідок, – осмотичного розриву клітини. PA, LF та EF експрескуються як три різні протеїни, але мають спеціальні сайти зв’язування для досягнення спільної мети. Спочатку PA взаємодіє із рецептором на поверхні еукаріотичної клітини. Наразі описано два клітинні рецептори PA – TEM8 та CMG2 – універсальні протеїни, що експресуються на всіх типах тканин. Після фіксації на рецепторі відбувається протеолітична активація PA поверхневою фуриновою протеазою клітини, що викликає олігомеризацію PA та його вбудовування у цитоплазматичну мембрану. Така подія веде до ендоцитозу пороутворюючого комплексу, а наявність доменів зв’язування LF та EF гарантує потрапляння токсинів всередину клітини. Коли ендосома перетворюється на вторинну лізосому і pH всередині неї різко знижується, відбувається зміна конформації олігомеру PA і він перетворюється на повноцінну мембранну пору, крізь яку відбувається викид LF та EF у цитоплазму клітини разом із потоком протонів.

Механізм дії антракс-токсину. Пояснення у тексті вище. Джерело Wikipedia

Ідея використання компонентів антракс-токсину для знищення клітин раку з’явилася на початку 2000-х, але просування у бік її практичного втілення почалося лише зараз. Група вчених Гарвардської Медичної Школи розробила метод прицільного наведення РА на певні клітинні рецептори на прикладі EGFR та HER2. Вони вирішили {ризикнути і} використовувати усі три компоненти токсину, але при цьому модифікувати специфічність PA протеїну (модифіковану версію вчені назвали mPA). Спершу, проаналізувавши структуру пороутворюючого комплексу вчені внесли дві амінокислотні заміни N682A та D683A, чим повністю позбавили PA протеїн здатності взаємодіяти із його природними рецепторами TEM8 та CMG2. Далі методом ПЛР із подовженням ділянок перекривання (overlap extension PCR), вони сполучили С-кінцеву ділянку mPA із геном епідермального фоктору росту (EGF). З метою перевірки ефективності такої конструкції була використана лінія клітин A431, що гіперекспресує рецептор EGFR. Дослідники спостерігали зростання внутрішньоклітинної концентрації cAMP та протеоліз серин/треонінових кіназ MAPK каскаду порівняно із контролем, що засвідчувало активність трикомпонентного антракс-токсину. Причому ці ефекти чітко залежали від зв’язування mPA-EGF гібридного протеїну із рецептором EGFR, оскільки у разі додавання надлишку вільного EGF (концентрація якого в 50 разів перевищувала таку mPA-EGF) показники cAMP та MAPK статистично не відрізнялися від контролю.

Розвиваючи своє дослідження, вчені вирішили створити іншу гібридну молекулу, яка б розпізнавала злоякісні клітини раку молочної зали, що гіперекспресують рецептор HER2. Оскільки природний ліганд HER2 рецептору досі невідомий, для прицілювання було використано так звану афінну молекулу – affibody molecule, розробкою якої людство за іронією долі також завдячує бактеріям. Affibody – це малий поліпептид (58 амінокислот), сконструйований на базі протеїну A Staphylococcus aureus. Бактерія використовує протеїн А для зв’язування та інактивації антитіл ссавця, чим уникає імунної відповіді організму господаря. Шляхом внесення амінокислотніх замін у ділянку, яка відповідає за специфічність зв’язування, вчені мають можливість програмувати різні affibody на розпізнавання теоретично необмеженої кількості амінокислотних послідовностей. Перевага affibody перед імуноглобулінами – класикою молекулярної біології – полягає у їхній простій структурі: вони не містять дисульфідних зв’язків, не вимагають особливих умов біосинтезу бо здатні до самовільного фолдингу, тому вони є надзвичайно термостійкими та pH-нечутливими. Отже, за аналогією із наведеним вище дослідженням вчені отримали гібридний протеїн mPA-ZHER2, що мав здатність взаємодіяти із рецептором HER2 з високою спорідненістю, і випробували токсин на культурі клітин HER2-позитивного трастузумаб-резистентного раку молочної залози. У результаті відбувалася прогнозована загибель злоякісних клітин. Але, що найголовніше,  вчені спостерігали селективну дію модифікованого токсину на клітини раку в разі його застосування у змішаній культурі клітин. Це засвідчує потенціальну можливість використання mPA-ZHER2 як специфічного протиракового агенту.

Нещодавно інша група вчених з Массачусетського технологічного інституту розробила  альтернативну стратегію. Вони вирішили використати інтактний PA, але натомість модифікувати другий компонент токсину, власне, летальний фактор LF. Їхня ідея полягала у тому, щоб «змусити» нативний PA транслокувати крізь клітинну мембрану малі афінні пептиди, які надалі будуть виконувати функції інгібіторів внутрішньоклітинних каскадів сигналювання. В своєму досліджені вони використовували monobody проти химерного онкогену Bcr-Abl та affibody проти серин/треонінової кінази c-Raf, яка є прото-онкогеном (monobody функціонально є тим самим, що affibody, проте має зовсім інше походження та будову; загалом ці афінні молекули є різновидами міметиків антитіл). Для цього вони сполучили кожну афінну молекулу із N-кінцевим фрагментом протеїну LF, який несе послідовність зв’язування із пороутворюючим протеїном PA. Оскільки раніше було відомо, що будь-які модифікації LF призводять до значного погіршення його здатності долати цитоплазматичну мембрану за допомогою PA (зокрема зелений флуоресцентний протеїн злитий із N-кінцевою ділянкою LF не проходить у цитоплазму клітини), було виконано низку експериментів для встановлення функціональності таких конструктів. По-перше, методом поверхневого плазмонного резонансу та ко-імунопреципітації було показано, що введення до структури афінної молекули N-кінцевого фрагмента LF не порушує її здатності зв’язуватися із своєю ціллю. По-друге, було доведено, що модифіковані афінні молекули ефективно проходять до цитоплазми, а принцип їхнього проникнення не відрізняється від LF токсину дикого типу. По-третє, вчені спостерігали зниження активності онкогенів Bcr-Abl та c-Raf у культурах клітин у порівнянні із контролем. Останнє спостереження є особливо важливим, адже дозволяє зробити висновок, що після транслокації крізь пору, утворену PA олігомером, малі афінні молекули успішно відновлюють свою третинну структуру і готові взаємодіяти із своїми цілями всередині клітини. На думку вчених, це пов’язано із малими розмірами таких молекул та їхньою здатністю до ре-фолдингу.

Схематичне зображення двох стратегій використання антракс-токсину для специфічної терапії раку. А: модифікований пороутворюючий протеїн PA + нативні токсини LF та EF. Б: нативний пороутворюючий протеїн PA + модифікований LF токсин. 1 – PA, зв’язаний із клітинним рецептором, проходить активацію шляхом обмеженого протеолізу фуриновою протеазою; (А) –  зв’язування опосередковане афінною молекулою, (Б) – PA взаємодіє зі своїм природним рецептором. 2 – олігомеризація PA та 3 – його взаємодія із N-кінцевою ділянкою токсинів. 4 – ендоцитоз токсинового комплексу, утворення вторинної лізосоми із кислим середовищем, конформаційний перехід олігомеру PA та утворення пори. 5 – викид нативних (А) або модифікованих (Б) токсинів у цитоплазму за градієнтом протонів. 6 – (А) – пряма цитопатична дія нативних токсинів, (Б) – блокування онкогену міметиками антитіл. Малюнок адаптовано з Liao, X. et. al. Delivery of Antibody Mimics into Mammalian Cells via Anthrax Toxin Protective Antigen. ChemBioChem, 2014; DOI: 10.1002/cbic.201402290

У підсумку ми маємо дві альтернативні стратегії використання системи токсинів Bacillus anthracis для прицільного знищення злоякісних клітин. Обидві вони засновані з одного боку на унікальних властивостях міметиків антитіл, а з іншого – на природному механізмі проникнення пептидів крізь цитоплазматичну мембрану еукаріотичної клітини. Перша стратегія передбачає націлювання безпосередньо на клітини раку і підходить для боротьби із пухлинами, які гіперекспресують визначений поверхневий маркер. В свою чергу друга стратегія спрямована проти специфічних продуктів всередині перероджених клітин, що робить можливим подолання пухлин, які не мають характерних рецепторів (а таких, до речі, більшість). Ще однією величезною перевагою афінних молекул є те, що їх можна піддавати «еволюції у пробірці» за допомогою технологій фагового, бактеріального, дріжджового, рибосомального або мРНК дисплеїв. Таким чином можна досягти високої специфічності зв’язування афінної молекули із онкогеном; теоретично така молекула здатна відрізнити патологічний протеїн від нормального, навіть якщо він різниться лише однією амінокислотною заміною. На даний момент, усі експерименти були виконані на культурах клітин in vitro, тому попереду ще дуже довгий шлях оптимізації цих стратегій на моделях in vivo та у клініці. Але наявні наукові результати доводять перспективність концепції сумісного використання антракс-токсину і технологій міметиків антитіл для розробки специфічної терапії злоякісних новоутворень.

Посилання

Стратегія модифікованого PA:

mBio

Molecular Oncology

Стратегія модифікованого LF

ChemBioChem

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s