Методом “еволюції у пробірці” розроблено молекулярну пастку для онкогенного протеїну

Схематичне зображення взаємодії рецептора Axl із фактором Gas6. Рецепторна тирозинкіназа Axl має незвичну для цього типу протеїнів структуру. Він складається з двох імуноглобулін-подібних доменів Ig1 та Ig2, за якими слідують два домени типу фібронектин ІІІ Fn1 та Fn2. У взаємодії із Gas6 беруть участь Ig-домени, причому перший зв’язує ліганд із високою специфічністю (high), а другий – із низькою (low). Стехіометрія зв’язування 2:2, при цьому відбувається димеризація рецепторів і їх аутотрансактивація. Розроблена пастка унеможливлює взаємодію Gas6 із рецептором, що призводить до блокування подальших сигнальних каскадів (посилання наприкінці)

Дослідники Стенфордського інституту розробили препарат, що здатен блокувати метастазування злоякісних пухлин, зокрема раку молочної залози та раку яєчника. Експериментальний терапевтичний агент являє собою штучний протеїн, що з високою ефективністю зв’язує фактор росту Gas6 (growth-arrest-specific protein 6), який присутній у крові пацієнта і може викликати активацію метастатичного фенотипу пухлини. Дослідження препарату на експериментальній мишачій моделі метастазування in vivo виявило, що він призводить до зменшення кількість вторинних пухлинних осередків на 78 % для перещепленої пухлини молочної залози та на 90 % – для раку яєчника.  Вчені назвали свою розробку протеїновою пасткою, якій під силу зупини розповсюдження раку.

Подібний підхід до обмеження метастатичного потенціалу пухлини не є новим. Ідея полягає у блокування протеїнових факторів, що циркулюють у крові або міжклітинному просторі й викликають виживання, розмноження і переміщення злоякісних клітин. Технологія здебільшого заснована на використанні антитіл, адже вони володіють природньою здатністю зв’язувати певні білкові мотиви. Таким чином, є способи, якими антитіло можна запрограмувати на розпізнавання і блокування певного «шкідливого» білку. Відтак, були спроби розробити вакцину до фактору росту васкулярного ендотелію (VEGF)  щоб організм пацієнта почав виробляти антитіла до цього фактора, що має убезпечити від метастазів. Також є повідомлення про використання моноклональних антитіл проти тканинної металопротеази-14, яка є невід’ємною компонентою шляхів неоангіогенезу та метастазування пухлин (дятальніше про матриксні металопротеази в метастазуванні раку тут). Проблемою використання імунотерапії в даному разі є те, що ефективність зв’язування антитіла із своєю ціллю широко варіює в різних експериментальних умовах. Тому спрогнозувати наскільки гарно воно буде справлятися із своєю задачею в організмі пацієнта майже неможливо, а вакцинація проти ендогенних протеїнів (як у випадку з VEGF, наведеному вище) може призводити до неконтрольованих тяжких побічних наслідків.

Сигнальні каскади, що активуються Axl рецептором у відповідь на зв’язування ліганду Gas6. Korshunov V.A. Axl-dependent signalling: a clinical update. Clinical Science (2012) V. 122: 361–368

Сигнальний каскад Gas6/Axl відносно нещодавно з’явився у фокусі вчених-онкологів. Axl є тирозинкіназним рецептором, який зв’язується із фактором Gas6 і запускає внутрішньоклітинні сигнальні каскади, зокрема PI3K/Akt, Grb2/ERK1/2 та каскади фосфоліпази С. Також є відомості, що Axl може опосередковано активувати малу ГТФазу Rho. Під час нормального ембріогенезу рецепторна тирозинкіназа Axl задіяна у проліферації та міграції клітин нейтральної ектодерми, а про гени раннього ембріогенезу відомо, що вони є потужними онкогенами у разі їх гіперекспресії в клітинах дорослого організму. Зокрема, було показано, що Axl, опосередковано через кіназу ERK1/2, здатен активувати програми епітеліально-мезенхімального переходу та інвазії – ключового етапу перетворення пухлини на злоякісну. Наразі доведено, що експресія Axl в клітинах раку молочної залози корелює із метастазування на несприятливим прогнозом. Декілька дослідницьких груп раніше намагалися розробити інгібітори рецептору Axl. Зокрема були спроби розробити моноклональні антитіла та ДНК-аптамери для блокування рецептору, а також застосувати специфічні інгібітори тирозинкіназ. Але усі ці спроби були безуспішними: заблокувати рецептор не вдалося, адже ані антитіла ані аптамери не володіли достатньою спорідненості до рецептора, щоб ефективно конкурувати, власне, із його лігандом Gas6; в свою чергу різні комбінації інгібіторів тирозинкіназ хоч і були ефективні, проте виявляли сильний побічні ефекти на модельних об’єктах.

У цьому світлі заслуговує окремої уваги метод, яким Стенфордські вчені розробили свою «пастку». Вони вирішили спрямувати свої зусилля не проти рецептору, а проти ліганду – вони створили дещо змінену версію Axl рецептору у формі розчинної молекули, здатної взаємодіяти із Gas6 із високим ступенем спорідненості. Це було досягнуто методом так званої «напрямленої еволюції» – шляхом отримання великої кількості мутантних варіантів рецептору Axl і подальшого відбору тих варіантів, які характеризувалися найміцнішою взаємодією із Gas6. Спочатку послідовність гену AXL, яка безпосередньо кодує ділянку, що задіяна у зв’язуванні із Gas6, ампліфікували спеціальною Taq полімеразою, схильною робити багато помилок під час копіювання ДНК у ході полімеразної ланцюгової реакції (так звана Error prone PCR). Частоту однонуклеотидних замін вчені варіювали підбором кількості циклів ПЛР та використанням аналогів азотистих основ. Надалі була виконана трансфекція мутованих послідовностей у клітини дріждів, що несли спеціальну плазміду для поверхневої експресії протеїну – так званий дріжджовий диспплей. Шляхом флюоресцентно активованого сортування клітин дріджів були відібрані ті мутантні варіанти, що мали найбільшу спорідненість із Gas6 (дріжджові клітини, що найкраще звязувалися із фактором Gas6, потрапляли у незабарвлену фракцію, а клітини незвязані зі фактором взаємодіяли із надлишком флюоресцентно мічених антитіл і відсортовувалися). Було проведено три раунди сортування із послідовним зменшенням концентрації ліганду (Gas6), щоб якомога краще очистити фракцію клітин, які мали найкращі характеристики звязування із лігандом. З отриманих у підсумку клітин секвенували фрагменти AXL гену, клонованого на початку. Таким чином вдалося з’ясувати, що одна з мутантних форм рецептору мала у десять разів більшу спорідненіть до Gas6, ніж Axl дикого типу. У подальшому отриману послідовність подовжили шляхом її злиття із Fc фрагментом IgG антитіла людини. Це було необхідно, оскльки надто короткий пептид фільтрувався б нирками з крові і не мав би жодного терапевтичного ефекту. На подив вчених така модифікація не погіршила здатності Axl-фрагменту з’вязувати Gas6, а навпаки підвищила спорідненість у шість разів порівняно з немодифікованим варіантом. У підсумку був отриманий гібридний протеїн, який здатен взаємодіяти із Gas6 у фемтамолярному діапазоні концентрацій (константа Міхаеліса реакції дорівнювала 420 fM), що у 80 разів міцніше за взаємодію Axl рецептора дикого типу і на три порядки (у 1000 разів) ефективніше за інгібітори Gas6/Axl сигнального каскаду, що були розроблені раніше.

Таким чином було отримано анти-метастатичний препарат, ефективність якого була доведена на модельних об’єктах in vivo. Попереду – клінічні випробування. Цікаво, що подібний підхід до розробки «пасток» для шкідливих протеїнів вже призвів до сворення терапевтичного засобу під назвою Etanercept, що нині застосовується проти ревматоїдного артриту. Тож, ефективність наведеної схеми дає привід сподіватися, що вона може стати основою для появи нового тренду у фармакології, і це дасть надію багатьом пацієнтам.

Посилання

ScienceDaily_Logo

Nature

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s