Подвійний удар по хронічній мієлоїдній лейкемії

Останні розробки в галузі дизайну специфічних препаратів свідчать, що застосування комбінації таргетних терапевтичних молекул або препаратів із розширеною специфічністю (так званих multi-target drugs, детальніше читати тут) поступово викристалізовується у новий сучасний тренд фармакології. В цьому плані було б зовсім не коректно оминути увагою нові можливості, що відкриваються у лікуванні хронічної мієлоїдної лейкемії (ХМЛ). Згадана гематологічна неоплазія є хрестоматійним прикладом дослідження молекулярних механізмів канцерогенезу. ХМЛ – перший тип раку, в якому в середині 70-х рр. ХХ ст. було виявлено специфічне генетичне порушення: реципрокну хромосомну транслокацію між 9 та 22 хромосомами. Далі на початку 80-х доведено, що транслокація є причиною експресії онкогену – химерного протеїну Bcr-Abl, який викликає неконтрольований поділ лейкемічних клітин. І нарешті на початку 2000-х рр. було введено у клініку перший у світі таргетний препарат, що націлений на онкоген Bcr-Abl. Таким чином третє тисячоліття ознаменувалося початком ери таргетної терапії раку. Також саме на ХМЛ були досліджені і сформульовані такі поняття як нестабільність геному злоякісної клітини та клональна еволюція, і вперше постало питання резистетності раку до таргетної терапії.

Молекулярні основи хронічної мієлоїдної лейкемії. Реципрокна транслокація між 9 та 22 хромосомами t(9;22) є характерним генетичним маркером ХМЛ. Внаслідок обміну хромосомними сегментами відбувається злиття генів BCR та ABL на вкороченому аддукті 22-ї хромосоми (аддукт має спеціальну назву – філадельфіська хромосома). Продуктом злитого гену є химерний протеїн Bcr-Abl, який є постійно діючою тирозин-кіназою, яка шляхом фосфорилювання запускає сигнали до проліферації та виживання лейкемічної клітини. Джерело: Fröhling S.,  et al, Chromosomal Abnormalities in Cancer. The New England Journal of Medicine. 2008; 359:722-34

Отже, онкоген Bcr-Abl є тирозинкіназою із постійною активністю, що здатна безконтрольно  запускати проліферацію в злоякісній клітині. Інгібітор тирозинкіназ під назвою іматиніб (та його модифіковані варіанти, представники другого і третього поколінь інгібіторів дазатиніб та нілотиніб, відповідно) здатні зупиняти активність онкогену шляхом блокування області протеїну, що задіяна у зв’язуванні АТФ. Таким чином вони позбавляють онкоген можливості фосфорилювати субстрати і стимулювати сигнальні шляхи виживання та проліферації клітини. Припинення активності Bcr-Abl призводить до масованої загибелі лейкемічних клітин і виявляється як гематологічна, цитогенетична та молекулярна ремісії. Ремісія в даному випадку визначається як неможливість ідентифікації лейкемічних клітин в зразку відповідними методами: гематологічним дослідженням мазку кісткового мозку, цитогенетичного аналізу метафаз клітин кісткового мозку та ПЛР-аналізом наявності мРНК транскриптів химерного гена в зразках кісткового мозку та крові пацієнтів. Оскільки роздільна здатність кожного наступного метода зростає приблизно із фактором 100х (гематологія виявляє 1 лейкемічну клітину на 100 нормальних, цитогенетика – 1 на 10000 нормальних, а молекулярка – 1 на 1000000 нормальних), то послідовні стадії ремісії являють собою глибше очищення кісткового мозку від злоякісних клітин. Слід зазначити, що кожний пацієнт характеризується індивідуальною відповіддю на терапію інгібіторами тирозинкіназ.

Інгібітори тирозинкіназ є хоч і порівняно ефективними ліками проти ХМЛ, проте нерідко у пацієнтів виникає резистентність до них, що супроводжується рецидивом захворювання. Несприйнятливість до селективного інгібітора часто спричинена мутаціями в АТФ-зв’язуючій кишені Bcr-Abl, які виникають у ході клональної еволюції злоякісних мієлоїдних клітин-попередників. Такі мутації  знижують спорідненість кишені до молекули інгібітору, при цьому не порушуючи функції взаємодії із АТФ. Нова хвиля лейкемічних клітин зазвичай представлена більш агресивним  злоякісним клоном, що має нижчий ступінь диференційованості і швидші темпи проліферації, і тому становить небезпеку для життя пацієнта. Вважається, що новий лейкемічний клон бере початок з нечисленної популяції клітин, яким вдалося «пережити» дію інгібіторів тирозинкінази Bcr-Abl. Така популяція називається мінімальної залишкової хвороби, вона є настільки малою, що навіть молекулярний аналіз за допомогою ПЛР, що володіє найбільшою роздільною здатністю, не може детектувати ці клітни. Зважаючи на це, нові підходи до лікування хронічної мієлоїдної лейкемії базуються на пошуку способів елімінації не лише циркулюючих злоякісних клітин, а й клітин, що «переховуються» в мікрооточенні кісткового мозку.

Залишкові лейкемічні клітини характеризуються  генетичною нестабільністю, яка й дає їм звомогу розвинути резистентність до таргетних препаратів за описаним вище механізмом. Головним рушієм нестабільності  геному в клітинах ХМЛ є порушення сигнальних шляхів репарації ДНК, залежних від кінази Abl. За норми даний білок має ядерну локалізацію і є учасником систем репації ДНК. Але оскільки внаслідок хромосомної транслокації він експресується у складі химерного протеїну Bcr-Abl, що має цитоплазматичну локалізацію, Abl не може виконувати свої функції в ядрі. Проте у лейкозних клітинах працює резервний шлях репарації, регульваний протеїном RAD52. Таким чином злоякісній клітині вдається  утримувати хитку рівновагу між надто активною репарацією, яка унемжливила б геному нестабільність і клональну еволюцію, і відсутністю репарації взагалі, що неминуче привело б до загибелі клітини .

Схематичне зображення синтетичної летальності Bcr-Abl та RAD52. У нормальних клітинах c-Abl у кооперації із RAD52 підтримують нормальні темпи репарації ДНК, попереджаючи накопичення генетичних помилок у клітині. У разі транслокації t(9;22) c-Abl більше не може виконувати свої функції і темпи мутагенезу підвищуються, що призводить до нестабільності геному та клональної еволюції. Інгібування RAD52 в лейкемічних клітинах призводить до зростання частоти мутаційних подій до критичного рівня і загибелі клітини.

Дослідники з Temple University School of Medicine запропонували радикально новий підхід в лікуванні хронічної мієлоїдної лейкемії (ХМЛ), заснований на інгібуванні шляхів репарації ДНК в лейкемічних клітинах. У них виникла ідея заблокувати RAD52-залежний шлях репарації  і подивитись як це вплине на виживаність злоякісних клітин. За допомогою методів генної інженерії були сконструйовані ХМЛ-клітини із різними мутація в ДНК-зв’язуючому домені  білка RAD52. Виявилося, що RAD52-мутанти схильні до активнішого утворення дволанцюгових розривів ДНК та є більш схильні до апоптозу. Надалі група почала розробку стратегій інгібування репаруючого ензиму в клітинах ХМЛ. Розвязком цієї проблеми став ДНК-аптпмер, який відтворює  послідовність, що розпізнється білком RAD52. Відтак, аптамер займає ДНК-зв’язуючий домен протеїну RAD52, перешкоджаючи таким чином його зв’язуванню із пошкодженою ДНК, що в свою чергу унеможливлює репарацію. Отже, застосовуючи такий підхід, лейкемічні клітини позбавляються останнього оплоту підтримки цілісності генетичного матеріалу, і геномна нестабільність, що є рушієм прогресії захворювання, стає вбивцею злоякісних клітин. Це, по суті, типовий підхід до терапії раку на основі концепції синтетичної летальності. Застосування комбінації інгібіторів тирозинкіназ та анти-RAD52 аптамеру ймовірно дозволить досягнути глибших і триваліших ремісій і запобігти можливим рецидивам внаслідок загибелі клітин мінімальної залишкової хвороби. По ідеї, додавання аптамеру не повинно нашкодити іншим клітинам окрім лейкемічних, оскільки лише останні повністю залежать від RAD52 у здійсненні репарації , тоді як нормальні клітини мають інтактну Abl кіназу. Хоча є відомості про те, що інгібітори тирозинкіназ також мають помірну спорідненість до Abl дикого типу, тому питання токсичності в даному разі все ж залишається в силі і ставить цілі для подальших досліджень.

В той же час група дослідників University of California, San Diego School of Medicine спрямувала свою увагу на іншу властивість лейкемічних клітин – здатність до самовідновлення. В цьому контексті клітини ХМЛ нагадують стовбурові клітини гемопоезу: їм так само властива адгезія до ретикулоцитів і стромальних елементів кісткового мозку, які являють собою компоненти гемопоетичної ніші і постачають проліферативні стимули і поживні речовини. Вважають, що асоційована із нішою лейкемічна клітина під час поділу дає одну дочірню клітину, що виходить і з сприятливого оточення, і одну дочірню клітину, що лишається в ніші й може повторно входити в мітоз, підтримуючи таким чином популяцію злоякісних клітин ХМЛ. Тож, за аналогією із нормальним гемопоезом такі клітини називають стовбуровими лейкемічними клітинами (leukemia stem cells – LSC).

Дослідники повідомляють, що злоякісні ХМЛ-клітин, які здатні до самовідновлення, гіперекспресують аденозиндеаміназу-1 активну щодо РНК (adenosine deaminase acting on RNA 1 – ADAR1) – ензим, який в нормі активний лише на певних стадіях ембріопоезу та гемопоезу і відсутній в зрілих мієлоцитах. Функція ADAR1 полягає в редагуванні РНК – перетворенні аденозину в молекулі РНК на інозин, що в свою чергу призводить як до зміни кодону, так і до зміни сайту галуження під час сплайсингу, що дозволяє швидко отримувати нові ізоформи білкових молекул. Окрім плюрипотентних стовбурових клітин ADAR1 також активний в імунних клітинах під час вірусної інфекції, зокрема експресію ADAR1 запускають компоненти сигнального каскаду інтерферону-γ. Чому надекспресія ADAR1 асоційована із самовідновленням клітин ХМЛ наразі невідомо. Шляхом секвенування транскриптому та кількісного аналізу мРНК-молекул за допомогою ПЛР в реальному часі, вченим вдалося прослідкувати зв’язок між експресією химерного протеїну Bcr-Abl в лейкемічних клітинах, індукцією прозапальних молекул в злоякісних мієлоцитах (зокрема рецептору до фактору некрозу пухлин) та активацією гену ADAR1. Тобто, активність онкогену Bcr-Abl прямо чи опосередковано через TNF-альфа веде до надлишкової експресії ADAR1, що за невідомим на разі механізмом надає ХМЛ-клітинам можливість самовідновлюватися.

Інший цікавий ефект надекспресії гену ADAR1 був описаний в ході дослідження активності  ектопічної копії згаданого гену в нормальних стовбурових клітинах гемопоезу (CD34+ CD38+ Lin). Також за допомогою секвенування продуктів зворотно-транскриптазної ПЛР в реальному часі було виявлено, що в ADAR1++ лейкемічних клітинах зсувається рівновага транскрипційних факторів, що відповідають за диференціювання гемопоетичних клітин: концентрація PU.1 зростає, а GATA-1 падає, що має наслідком переважне диференціювання незрілих попередників в мієлоцити. Можливо, в цьому полягає пояснення чому транслокація t(9;22), яка відбувається в стовбуровій кровотвірній клітині та призводить до експресії химерного протеїну Bcr-Abl, завершується експансією саме мієлоїдного паростка гемопоезу, що в результаті клінічно виявляється як хронічна мієлоїдна лейкемія. З дослідження постає ще один цікавий висновок: не лише нестабільність геномної ДНК може призводити до клональної еволюції та прогресії пухлинної хвороби (в даному випадку переходу ХМЛ з хронічної фази до фази акселерації та бластного кризу), але й посилене РНК-редагування, зумовлене підвищеною активністю ADAR1, може спричинити подібні наслідки (дивитися узагальнені відомості на малюнку нижче). На останок, у разі нокдауну ADAR1 за допомогою  малих інтерферуючих РНК веде гальмування проліферації клітин ХМЛ в стадії бластного кризу. Сукупно, дані вказують, що блокування аденозиндеаміназ  в клітинах ХМЛ може покращити терапевтичній ефект шляхом: 1) послаблення потенціалу самовідновлення стовбурових лейкемічних клітин, 2) стимуляції диференціювання гемопоетичних стовбурових клітин в інші клітинні типи, окрім мієлоцитів і 3) зменшення частоти мутацій, що буде стримувати клональну еволюцію. Ці ефекти можна використати в цілях більш глибокого очищення кісткового мозку від клітин ХМЛ у разі комбінованого застосування блокаторів ADAR1 з інгібіторами тирозинкіназ, а також для «порятунку» пацієнтів на просунутих стадіях ХМЛ, коли тирозинкіназні інгібітори вже не діють.

Узагальнення результатів, отриманих у ході дослідження ADAR1 в клітинах хронічної мієлоїдної лейкемії 

<попередня тема Використання комбінації специфічних інгібіторів || наступна тема Подолання негативних побічних наслідків таргетної терапії інгібіторами тирозинкіназ>

Посилання

 

 

Advertisements

Залишити відповідь

Заповніть поля нижче або авторизуйтесь клікнувши по іконці

Лого WordPress.com

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис WordPress.com. Log Out / Змінити )

Twitter picture

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Twitter. Log Out / Змінити )

Facebook photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Facebook. Log Out / Змінити )

Google+ photo

Ви коментуєте, використовуючи свій обліковий запис Google+. Log Out / Змінити )

З’єднання з %s